1、实验目的

(1)了解HPLC在中药分析方面的应用。

(2)熟悉梯度洗脱的设计和操作。

2、实验原理

中药(植物药)中，含有多种有机和无机化合物，如生物碱、黄酮、皂苷、多聚糖等。每一味中药都有它独特的一种或几种主要有效成分。弄清中药的有效成分是中药分子药理学的关键，川芎中的有效成分之一是藁木内酯。中药的传统炮制法是水煎，因此很多水溶性(极性)物质被提取出来，由于这些水溶性有机分子的协同作用，也会有很多脂溶性(非极性)物质被提取出来。本实验采用反相HPLC体系来分离川芎提取液。在反相HPLC中，极性物质先流出，非极性物质后流出。要能在尽可能短的时间内达到较好的分离，选择适当极性的流动相是关键。对于较简单的样品可以采用均一的混合溶剂作为洗脱液(称等强度洗脱)，但对于复杂的混合物，如中药提取物，必须采用梯度洗脱的方法，既流动相的极性随时间在变化，洗脱能力不断增加，使各组分既能得到彼此的分离，又能使色谱峰分布均匀。

川芎中有机物在210～300nm范围内有较强的吸收。因此可采用紫外检测器进行检测。采用外标法(一点工作曲线法)对川芎的主要成分藁本内酯进行定量。

3、仪器与试剂

仪器：高效液相色谱仪，紫外检测器，梯度淋洗装置，溶剂脱气装置。

试剂：甲醇(色谱纯)，水(重蒸去离子水)，川芎浸膏，藁本内酯标准样品。

4、实验内容与步骤

(1)参照仪器使用说明，使仪器处于工作状态。

(2)设置色谱参数：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，B为水；流速为1.0mL／min，柱温30℃；检测波长270nm。

(3)配置藁本内酯标准样品溶液：准确称量藁本内酯标样，以甲醇为溶剂配置，浓度约为1000mg／L。

配置被测样品：称取川芎浸膏250mg，用甲醇溶解定容至50mL。

(4)先以50 %的甲醇／水溶剂等强度洗脱，用六通阀注入被测样品，观察分离情况。

(5)再以80％的甲醇／水溶剂等强度洗脱，重复(4)的操作。

(6)设置梯度程序：开始为90％的B，60min内线性地改变为100％A，用六通阀注入被测样品，观察分离情况。

(7)检测波长分别设为260nm，280nm，注入被测样品。

(8)选择适宜的色谱条件(流动相，检测波长)注入藁本内酯标样，记录保留时间和峰面积(用以定性和计算校正因子)，重复3次，取平均值(面积误差小于3％)。

(9)注入被测川芎提取液样品，重复3次，取平均值(面积误差在3％之内)。

(10)按关机程序关机。

5、注意事项

(1)如果实验直接用市售川芎饮片作样品时，可以称取适量饮片，用水提取1h(保持微沸)，水提物用微孔膜过滤后直接进样，或用氯仿等溶剂萃取后进样。

(2)中药提取物中成分复杂，所含糖类、蛋白类等物质有可能使色谱柱性能下降，必要时将川芎浸膏用温水溶解后，用氯仿或乙酸乙酯萃取，有机相作为样品即可。

6、数据处理

(1)整理出不同条件下的色谱峰的保留时间、峰面积，计算藁本内酯的分离度。

(2)用外标法计算川芎浸膏中的藁本内酯的含量。